تشخیص مشکلات کروماتوگرافی و عیب یابی

در آموزش HPLC ما ، اغلب از ما سؤال می شود "تأثیر اضافه کردن طول لوله قبل از ستون روی کروماتوگرافی در یک اجرا ایزوکرات؟"در نتیجه استفاده از یک لوله طولانی تر قبل از ستون ، همانطور که در بالا نشان داده شده است ، افزایش زمان احتباس در سمت راست رخ می دهد. این افزایش زمان احتباس در قله های بعدی (از پایین به کروماتوگرام های بالا) آشکارتر است. دلیل آن در نمودار بعدی نشان داده شده است.

مخلوط تست پارابن ، ستون ID 4. 6 میلی متر ، شستشوی ایزوکراتیک ، 1. 5 میلی لیتر در دقیقه

دینامیک جریان و تزریق

پس از تزریق ، آنالیت یک باند محکم است. با عبور از باند آنالیت ، برای رسیدن به ستون ، به یک پروفایل جریان لمینار پارابولیک (به دلیل کشیدن روی دیواره لوله) تغییر می کند.

با حرکت نمونه از طریق لوله ، گسترش باند افزایش می یابد. لوله های بیشتر ، گسترده تر پراکندگی

تأثیر حجم باطل

اتصالات نصب شده ضعیف در سر ستون می تواند منجر به از بین رفتن راندمان جداسازی و نشت شود. هنگامی که عمق نصب لوله با عمق نصب ستون مطابقت ندارد ، می تواند حجم باطل رخ دهد. توجه بیشتر با عمق نصب در هنگام استفاده از لوله های استیل ضدزنگ و اتصالات قبل از ستون مورد نیاز است. توجه داشته باشید که اتصالات از جمله آجیل نر و فرول از تولید کنندگان مختلف ممکن است دارای طرح های مختلفی باشند و نباید از آنها مخلوط شوند. به عنوان یک نتیجه ، فرول نمی تواند به درستی بنشیند و حجم باطل (همانطور که در تصویر نشان داده شده است) یا محفظه اختلاط شکل می گیرد. اتصالات ضعیف باید از قله قله مورد بررسی قرار گیرد. اطمینان حاصل کنید که اتصالات محکم هستند اما اتصالات بیش از حد به طور دائم به اتصالات آسیب می رساند و فشار سیستم را افزایش می دهد. از طرف دیگر ، اگر همزمان با افزایش فشار کمر باشد ، می تواند به دلیل آلودگی ذرات در سیستم باشد.

لوله برش

اتصال ضعیف نیز به دلیل برش نامناسب لوله ممکن است رخ دهد. که منجر به تشکیل محفظه اختلاط و در نتیجه بر کروماتوگرافی می شود. به دلیل پایداری فشار این لوله ، معمولاً از لوله های فلزی ضد زنگ قبل از ستون استفاده می شود. این تصویر سطح مسطح مناسب برش را برای یک تولید کننده از پیش برش تولید کننده نشان می دهد. سطح غیر پلاناری ناهموار از یک لوله برش توسط یک برش لوله تجاری و اثرات آن نشان داده شده است. حداکثر مسئله در افزایش حجم باطل ، خیاطی و نشت با لوله برش پرونده به دلیل سطح غیرقانونی ناهموار شدید آن از برش مشاهده می شود.

قصور

برش لوله ای ضعیف می تواند یک خلاء ایجاد کند و در نتیجه خیاطی ایجاد شود. این اثر با ستون های LC با حجم کوچک بیشتر برجسته می شود

نرخ دستیابی به داده ها

بیایید در مورد اهمیت نرخ جمع آوری داده ها صحبت کنیم. میزان کسب یک ردیاب (به عنوان مثال ، UV-Vis یا PDA) به عنوان تعداد امتیازات گرفته شده در یک ثانیه تعریف شده است. هرچه تعداد بیشتر باشد ، نقطه داده بیشتر گرفته می شود. ردیاب نقطه به دست آمده در یک بازه زمانی مشخص و میانگین آنها را می گیرد. از میانگین نقاط داده برای ساخت کروماتوگرام استفاده می شود. حداقل 10 نقطه داده در سراسر اوج شکل اوج گاوسی متقارن صاف را نشان می دهد. این برای کروماتوگرافی قابل قبول و قابل تکرار مهم است.

ثابت زمان (پاسخ)

با انتخاب مناسب ثابت زمان ردیاب ، سر و صدای آشکارساز کوتاه مدت قابل بهبود است. زمان ثابت یا پاسخ ردیاب اساساً دوره زمانی است که ردیاب به طور متوسط سیگنال را دارد. این مثال ، کروماتوگرام یکسان را در زیر پاسخ آشکارساز مختلف (ثابت زمان متفاوت) نشان می دهد. ثابت زمان طولانی تر نویز را به طور مؤثرتری مرطوب می کند اما می تواند قله ها را مرطوب کند. پیدا کردن یک زمان بهینه ثابت است که در میرایی نویز مؤثر است اما شکل اوج نیست.

تغییر سرعت جریان

افزایش سرعت جریان آنالیز را سریعتر از بین می برد. در یک روش ایزوکراتیک ، زمان احتباس را کاهش می دهد اما ترتیب شستشو همان را حفظ می کند (فقط اجرای ایزوکرات).

سرعت جریان زمان احتباس و زمان اجرا را تحت تأثیر قرار می دهد اما ترتیب شستشو قله ها را تغییر نمی دهد

حجم مختلف تزریق

این تصویر نشان می دهد که چگونه افزایش حجم تزریق بر سطح اوج ، عرض و ارتفاع تأثیر می گذارد. بنابراین ، داشتن یک پاسخ ردیاب خطی برای محدوده انتخاب شده حجم تزریق بسیار مهم است.

• با افزایش حجم تزریق ، سطح اوج ، عرض و ارتفاع نیز چنین می شود

• ایده آل برای داشتن یک پاسخ ردیاب خطی به عنوان حجم تزریق متنوع است

این تصویر نمایانگر "استحکام شستشو" یک حلالها برای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس است. استحکام شستشو اندازه گیری این است که چگونه حلال می تواند یک آنالیت را از ستونی که در آن حفظ شده است "بیرون بکشد. تتراهیدروفوران (THF) تمایل به تشکیل پراکسیدهای بسیار انفجاری دارد ، این یک حلال قوی تر در مقایسه با استونیتریل و متانول است.

حلال های مختلف تزریق

شکل پیک را می توان تحت تاثیر حلال تزریقی قرار داد. بهتر است در صورت امکان نمونه در شرایط فاز متحرک اولیه حل شود. در این مثال، تزریق نمونه ها در یک حلال قوی (استونیتریل) زمانی که یک فاز متحرک ضعیف (متانول/آب) استفاده شد، منجر به گشاد شدن پیک شد. زمانی که از یک حلال قوی تر (IPA) استفاده شد، انبساط اوج بسیار شدید بود.

شوینده: 55/45 MeOH/آب

یک گرادیان مسطح یا کم عمق تر، وضوح متوسط را افزایش می دهد، مجموع تمام وضوح ها افزایش می یابد. با شیب کوتاه‌تر، قله‌ها زودتر از بین می‌روند، اما ناحیه قله‌ها باریک‌تر است. شیب تند حد تشخیص را کاهش می دهد. یک گرادیان مسطح اغلب منجر به بهبود وضوح در قسمت بعدی کروماتوگرام می شود (همانطور که در این تصویر نشان داده شده است). شیب طولانی اغلب تنها برای قله‌های در حال فرار منجر به وضوح بهتر می‌شود. به خاطر داشته باشید که یک گام ایزوکراتیک در آغاز می تواند اما نه همیشه وضوح را بهبود بخشد. لطفاً توجه داشته باشید که %B اولیه برای قله‌های «جلو» و %B نهایی برای قله‌های «پایان» مهم است. بنابراین برای دستیابی به یک اجرای موفق گرادیان، از یک شروع معقول %B استفاده کنید و در ابتدا فقط شیب مورد نیاز را تغییر دهید.

نرخ تغییر آلی/زمان در مثال اول کمتر است بنابراین انگیزه کمتری برای بیرون کشیدن آنالیت از ستون وجود دارد. شیب در مثال دوم بیشتر است و آنالیت سریعتر خارج می شود

این تصویر شتاب جداسازی از طریق افزایش دما را نشان می دهد. احتباس از پایین ترین به بالاترین دما کاهش می یابد. توجه داشته باشید که قله ها در دمای بالا بسیار واضح تر به نظر می رسند. این نظریه با سینتیک کروماتوگرافی و توسط نظریه ون دیمتر توصیف می شود. افزایش دما باعث تسهیل انتشار می شود که برای دستیابی به راندمان اوج خوب مهم است. به عنوان یک قاعده کلی، برای اجرای ایزوکراتیک، ماندگاری 1-2٪ برای هر درجه (درجه سانتیگراد) تغییر دما تغییر می کند.

ستون ID 2. 1 میلی متری، 0. 35 میلی لیتر در دقیقه، 50/50 MeOH/آب

قوانین عیب یابی

5 نکته کلیدی برای عیب یابی

• قانون یک (روش KISS) - فقط یک مورد را در یک زمان تغییر دهید یا تغییر دهید

• قانون دو - یک "مشکل" تا زمانی که حداقل دو بار رخ ندهد وجود ندارد

• آن را برگردانید - اگر قسمتی را عوض کردید و مشکل را حل نکرد، اما قسمت اصلی را برگردانید

• آن را دور بیندازید - اگر قسمتی منقضی شده یا شکسته است - آن را دور بریزید.

• آن را یادداشت کنید - هر سیستمی باید یک دفترچه یادداشت برای ثبت هرگونه خدمات و/یا عملیات نگهداری داشته باشد.

جان دبلیو دولان، یکی از سردبیران مجله LC-GC، (LC-GC 6، 30 4-308، 1988)

ارتفاع اوج من در حال کاهش است اما منطقه و زمان نگهداری من یکسان است

احتمالی مقصر: ستون

• ستون شستشو در هر دستورالعمل سازنده. اگر کروماتوگرافی به تخریب ادامه می یابد ، ستون را جایگزین کنید.

• اگر فهمیدید که باید هر چند ماه به طور مداوم ستون ها را جایگزین کنید ، روش خود را دوباره ارزیابی کنید. ممکن است لازم باشد یک مرحله پاکسازی نمونه را درج کنید یا یک ستون نگهبان نصب کنید.

زمان احتباس من تغییر می کند* بالاتر/پایین اما منطقه یکسان است

احتمالی مقصر: پمپ

• پمپ را پاک کنید و سعی کنید دریچه های چک را تمیز کنید.
• احتمالاً مواد مصرفی باید روی پمپ آبی جایگزین شوند.
• نشت را بررسی کنید و PM را انجام دهید.

*اجرا کنید تا تغییر RT از 0. 02-0. 05 ± ± اجرا شود ، اما از رفتار روش باید برای تعیین تغییر طبیعی استفاده شود.

• پمپ را پاک کنید و سعی کنید دریچه های چک را تمیز کنید.
• مواد مصرفی احتمالاً باید روی پمپ ارگانیک جایگزین شوند.
• نشت را بررسی کنید و PM را انجام دهید.

در صورت استفاده از FCV یا LPGE ، اطمینان حاصل کنید که تمام خطوط فاز تلفن همراه در ابتدا قرار دارند (حتی مواردی که از آنها استفاده نمی کنید).